表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中，利用Lipofectamine^TM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞，直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察，在3种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多，总的来看，在PK 15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后，都可以观察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测，PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达，单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。     

猪囊尾蚴特异性单克隆抗体的制备及其识别抗原成分的鉴定

通过SDS-PAGE方法对猪囊尾蚴囊液抗原成分进行了分离鉴定,并分别分离纯化了其中的16 000和10 000特异性蛋白质成分;将16 000和10 000纯化蛋白质成分分别做成佛氏佐剂苗,分组免疫BALB/c小鼠,超免后,无菌取脾脏制备脾细胞,分别与NS0骨髓瘤细胞进行融合,经阳性筛选和特异性鉴定获得2株分泌猪囊尾蚴特异性单抗的杂交瘤细胞,命名为TSCF-1611H12B8和TSCF-1012G5B5。免疫学鉴定结果表明,单抗TSCF-1611H12B8和TSCF-1012G5B5与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫、住肉孢子虫和蛔虫抗原间不存在交叉反应;单抗TSCF-1611H12B8识别囊液中16 000和10 000蛋白质抗原条带,而单抗TSCF-1012G5B5识别囊液中的10 000蛋白质条带。     

我国南方猪高热病的研究(Ⅰ)——大肠杆菌的分离、鉴定和致病性测定

从湖南3个高热病发病猪场11头病死猪的病料组织中均分离出了大肠杆菌,经血清学鉴定,鞭毛抗原(K88、K99、987P和F41)全为阴性反应。经过157种菌体抗原血清学检测,血清型为5、6、15、22、32和83型。药物敏感试验结果表明,分离的大肠杆菌对大多数常用药物耐药,对氟喹诺酮和头孢类药物敏感。将其中4头猪原代分离的大肠菌培养物以原倍(2×107个/mL)、104和108稀释的菌液分别感染18~22 g小白鼠,原倍菌液感染的小白鼠12/30在感染后24 h内出现死亡,而104和108稀释菌液感染的小白鼠均健活;将未经除菌的病死猪组织悬液、过滤除菌的组织悬液、大肠杆菌、过滤除菌的组织悬液及大肠杆菌分别感染30日龄左右的健康小猪,除未经除菌的组织悬液感染猪3/3发病,2/3死亡外,其余所有感染猪只出现体温升高,升幅达1~2℃,减食,精神萎靡,但没有死亡;将死亡猪再次分离到的大肠杆菌感染小白鼠和猪,小白鼠12/15出现死亡,感染猪只出现体温升高(超过1℃),没有出现死亡。结果证明:大肠杆菌在高热病的发病过程中只起协同诱发作用,引起猪发病死亡的真正原因可能是病毒感染。     

水貂隐孢子虫病流行病学调查及虫种的初步鉴定

为初步了解水貂隐孢子虫病的流行情况,作者于2005年11月份用饱和蔗糖溶液漂浮法检查了河北省肃宁县某水貂养殖场的469份粪便样品。结果,8份粪便样品为隐孢子虫阳性,总感染率为1.71%(8/469)。其中,白貂感染率为2.15%(5/233)、灰貂感染率为2.08%(1/48)、黑貂感染率为1.06%(2/188)。所查的8份隐孢子虫阳性样品均来自5~6月龄的水貂,表明幼龄水貂容易感染隐孢子虫病而老龄水貂不易感染。另外,8份阳性样品多数来自雄性水貂,显示水貂的隐孢子虫感染可能存在性别的差异性。根据卵囊形态和大小将水貂隐孢子虫初步鉴定为小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)。同时,利用所收集的隐孢子虫卵囊进行了小白鼠感染试验,结果表明水貂源隐孢子虫不感染免疫抑制状态下的昆明系小白鼠。     

9株猪瘟分离毒株的致病特性

采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试验猪进行同居感染.如此进行,GDGZ1/95、BJCY1/96和JL1/94传至8代;FJFQ1/99传至7代;HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJTX3/96、GXBH1/98和HeNXH2/98传至3代.结果显示:上述分离株传至3～5代过程中均表现出毒力增强的趋势,从3～5代传代到8(7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定,且均超过了标准石门强毒株的发病特点.所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状,解剖后均表现出不同程度的病理变化,死后或解剖后的各种脏器经HCFA检查均为强阳性,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物,各毒株之间毒力没有明显差异.对其中7株分离株传代血毒部分代次E2基因主要区域进行序列分析,结果仅GDGZ1/95株从F1～F8代中的F6代有2个核苷酸的差异,引起1个相应氨基酸的变异,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性.     

猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

实时荧光定量PCR检测PrP基因在金黄地鼠脑组织的动态表达

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,其脑组织内朊蛋白基因动态表达数据的测定对探讨该类疾病的发生、发展和分子致病机理具有重要意义。我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,对不同年龄金黄地鼠大脑、小脑、丘脑和脑干PrP基因的表达进行了定量。结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量,但是同一年龄段不同组织每纳克总RNA中朊蛋白基因的表达量和每毫克组织中朊蛋白基因的表达量有显著的差别,不同组织在不同年龄出现表达高峰。本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和脑组织在传染性海绵状脑病病理发生中的作用,提供了基础数据。     

脑囊虫病抗体检测方法研究进展

囊虫病是由猪带绦虫幼虫——猪囊虫引起的一种重要的人畜共患病。猪囊虫可寄生于猪、野猪、人、骆驼、猫等动物的肌肉、大脑、皮下和眼部等多个器官等,能引起不同程度的发病。仔猪患该病后发育不良,肉品质下降。人感染囊虫会引起不同部位的病变,其中最为严重的是脑囊虫病,它主要是由于人摄入猪带绦虫虫卵或猪带绦     

猪囊尾蚴循环抗原和排泄分泌抗原研究进展

猪囊尾蚴病是由带科(Taeniidae)带属(Taenia)的猪带绦虫(有钩绦虫)(Taenia solium)的幼虫-猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)寄生于猪的肌肉和其他器官中而引起的一种人畜共患寄生虫病,俗称囊虫病。该病主     

仔猪非感染性腹泻的病因分析及防治

分析了仔猪非感染性腹泻存在的依据，着重从营养因素、管理因素和环境因素三方面论述了引起仔猪发生腹泻的主要原因及针对各种原因提出相应的防治措施。